Piattaforma di Spettrometria di Massa: Proteomica e Metabolomica

Piattaforma di Spettrometria di Massa: Proteomica e Metabolomica
Responsabile: Prof Fulvio Magni

Piattaforma di Spettrometria di Massa dedicata prevalentemente alla Proteomica e Metabolomica

Nella piattaforma localizzata nella “casa della Ricerca e dell’Innovazione” (Edifico U28) operano un team di chimici, biochimici, biochimici clinici e clinici volti alla caratterizzazione delle alterazioni molecolari dei processi bio/fisiologici alla base delle varie patologie umane, alla scoperta e validazione di marcatori, alla identificazione e quantificazione di piccole molecole in diverse tipologie di campioni. Il team ha collaborazioni sia con enti pubblici che privati a cui offre il suo expertise in diversi settori (farmaceutico, alimentare, cosmetico, ambientale, diagnostico e clinico). Il team ha collaborazioni attive sia nazionali che internazionali in diversi ambiti. E’ in grado di sviluppare e validare metodiche analitiche basate sulla spettrometria di massa.

Risorse tecnologiche ed expertise disponibili

Expertise

Il team ha consolidato la sua esperienza in diversi settori di applicazione che includono l’analisi tramite GC/LC-MS/MS di farmaci e piccole molecole, e lo studio del proteoma e del metaboloma mediante spettrometria di massa. In particolare, in quest’ultimo campo, tramite approcci, sia di tipo top-down che bottom up, può sostenere progetti volti ad identificare il proteoma/peptidoma, le sue alterazioni qualitative (modificazioni post-traduzionale quali ad esempio la fosforilazioni, N-glicosilazione etc.) e quantitative in svariate tipologie di campioni e validarne i risultati. Dispone della tecnica di “Imaging” in spettrometria di massa per l’ottenimento della distribuzione spaziale delle molecole di interesse direttamente sui tessuti, organi e cellule. E’ in grado di studiare anche il metaboloma mediate tecnica di identificazione/ quantificazione untargeted e targeted sia con GC-MS/MS che con LC-MS/MS. Inoltre il team possiede un comprovato expertise nella gestione di matrici biologiche di diversa natura per numerosi studi biochimici anche multicentrici.

Nello specifico, l'unità di Proteomica e Metabolomica si avvale delle seguenti principali strategie di proteomica e metabolomica per applicazioni a campioni liquidi quali fluidi biologici (siero, urina, plasma, FNAB, ecc.) e solidi (tessuti, colture cellulari, microrganismi, scaffold, ecc.):

PROTEOMICA

a) Identificazione del proteoma / peptidoma e caratterizzazione delle loro modificazioni (es. fosforilazione, glicosilazione, ecc.) mediante approcci shotgun e top-down con nanoLC-ESI-QqTOF e nanoLC-ESI-ETD-MS /MS.

b) Quantificazione relativa di peptidi/proteine con protocolli sia label-free che label-based, tramite cromatografia liquida mono e bidimensionale combinata con la MS/MS;

c) Profilo del proteoma / peptidoma ed identificazione in situ mediante MALDI-TOF / TOF

IMAGING

d) Imaging mediante spettrometria di massa per definire la localizzazione spaziale di proteine intatte / peptidi / N-glicoproteine, lipidi e piccole molecole all'interno del tessuto (congelato fresco, FFPE e TMA), le loro alterazioni e per costruire immagini molecolari del campione.

METABOLOMICA

E’ in grado di caratterizzare il metaboloma mediate tecnica di identificazione / quantificazione untargeted e targeted sia con GC-MS/MS che con LC-MS/MS.

Risorse tecnologiche

La piattaforma di Spettrometria di Massa dispone di 2 MALDI-TOF/TOF e 2 LC-MS/MS ed 1 GC-MS. Inoltre sono disponibili anche diverse strumentazioni per Elettroforesi mono/Bidimensionale (2D-EF) e per la validazione con anticorpi. La piattaforma dispone anche di server e software specifici per la gestione dei dati da spettrometria di massa e per le applicazioni specifiche.
Strumentazione:
MALDI-TOF/TOF: Rapiflex e UltrafleXtreme (Bruker Daltonics);
Questi spettrometri di massa sono di nuova generazione con elevata precisione e sensibilità. I due MALDI-TOF / TOF hanno una risoluzione di oltre 40.000 RP e una precisione di massa migliore di 2-5ppm. La sensibilità è nell'ordine di poche femtomoli.
Rapiflex è specificamente progettato per l'imaging MS con una risoluzione spaziale di 10-20 micron, così da ottenere informazioni a livello della singola cellula, e con una velocità 10 volte migliore rispetto ad altri strumenti commerciali MS-Imaging.
NanoLC-ESI-MS/MS (Bruker Daltonics): nanoLC Ultimate 3000 interfacciato a ESI-ETD-MS / MS (Amazon-ETD) e nanoEASY-LC combinato con Impact Qq-TOF.
Il nanoLC-ESI-Qq-TOF ha una risoluzione costante superiore a 40.000 RP e una precisione fino a 1-2 ppm. Questi due strumenti consentono l'identificazione rapida e affidabile di proteine/peptidi, l'abbondanza relativa e la caratterizzazione delle loro PTMs.

Elaborazione dei dati

L'identità di proteine e peptidi è ottenuta tramite Mascot (MatrixScience; in-house version) e Peaks Studio (Bioinformatics). L'abbondanza relativa di peptidi e proteine nei campioni, misurata come rapporto, è calcolata con Progenesis-QI (Waters) e Peaks Studio.
I dati di MS-Imaging sono elaborati con SCILS (vers. 2016b) e con programmi sviluppati internamente per scopi specifici.